三、细胞培养基的使用方法

　　细胞培养基的种类繁多，细胞培养方式也较多，如何正确地使用培养基及最大程度地保持培养基的营养以维持细胞的生长，对每个培养者都很重要。培养基的使用依不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。
3.1 细胞培养液的成构
　　细胞培养液指细胞生长的液体环境，一般指完全培养液，添加了血清、水解乳蛋白、各种添加剂等可以直接使用的培养液。
3.1.1 细胞培养基&血清模式
　　血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是需要的，因为大多数单独的培养基并不能提供细胞生长所需要的全部营养，如MEM培养基，较为常用的量为5％-10％的比例，而特殊的低血清培养基血清量可降至3％左右，细胞的形态和功能不受影响。
3.1.2 细胞培养基&乳欧液模式
　　化学合成培养基现虽已大规模使用，但在某些培养领域水解乳蛋白仍在使用，以补充培养液中缺乏的氨基酸、小肽物质。较为常用的方式是用汉氏（Hanks′BSS）或欧式(Earle′s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般为5‰浓度），即成乳汉（欧）液，再与化学合成培养基（一般为MEM）按比例混合使用（如1:1）。
3.1.3 细胞培养基&各类添加剂（生长因子等）模式
　　成分复杂的培养基还含有许多化合物，包括蛋白质、多肽、核苷、柠檬酸循环的中间产物、丙酮酸及脂类等。已发现当培养基中的血清浓度减少时，这些成分都是必需的。既使在使用血清的情况下，这些成分也可帮助细胞的克隆化培养及维持某些特殊细胞系的生长。激素和生长因子在大多数常规培养基的配方中都没有注明，但在无血清培养基中通常要加入它们，用其来代替血清中的激素能增加多种不同类型细胞的贴瓶率；生长因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生长因子和细胞因子有着广泛的特异性，一般与激素或其它物质起相互协同或加成作用。另一种常见的添加物就是血清替代物，目前已有许多可完全或部分替代传统培养液中血清成分的商业产品，其稳定性较好，但批次间仍有差别，产品的成分也不很确定。
3.2 细胞培养基的选择
3.2.1根据细胞或病毒特性、培养方式选择合适培养基
　　不同的细胞株和培养条件都有着不同的营养需求，这就需要配一个最优化的细胞培养基，才能够提高生物制品的产率。
3.2.2 选择高品质的细胞培基养
　　细胞培养基产品应该符合国家化工行业标准；细胞培养基的生产更应该实施GMP 管理。我国对药品生产实施GMP 管理，但用于生物制品（药品）生产的细胞培养基却未纳入其中。细胞培养基作为生物制药的重要原料，从人员、设施与设备、生产过程、质量控制等方面须严格按GMP 要求进行生产，这是保障细胞培养基合格产品生产的必要条件。
3.2.3 从经济性角度选择合适的细胞培基养
　　不论是疫苗生产，还是抗体生产，采用高品质、更符合生产实践的个性化细胞培养基，才能从根本上提高生物制品质量，降低生物制品的综合生产成本。
　　（1） 提高了细胞密度和细胞活力；
　　（2） 提高了单位体积培养液中病毒量或抗体表达量，提高了生产效率；降低了动物来源成分，简化纯化成本，提高了生物制品的安全性。
3.3 细胞培养基配制
3.3.1干粉培养基原倍液的配制
　1）配制过滤除菌的细胞培养基
　　(1) 阅读培养基使用说明，确定需要添加何种添加剂（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等）。
　　(2) 根据所需将培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至总体积的95％，轻微搅拌溶解。
　　(3) 加入规定量的碳酸氢钠及所要添加的物质。
　　(4) 轻微搅拌溶解，加注射用水至规定体积。
　　(5) 用 1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol / L 盐酸溶液调pH至所需值。
　　(6) 用 0.22μm滤膜正压过滤除菌。
　　(7) 溶液应在2℃－8℃下避光保存。
　　具体使用方法参照培养基包装袋上的说明书。
　2）配制可高压灭菌细胞培养基
　　(1) 根据所需将培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至总体积的95％，轻微搅拌溶解。
　　(2) 在 121℃、15psi下灭菌15分钟。
　　(3) 待溶液冷却至室温，加入无菌0.2mol / L L－谷氨酰胺溶液规定体积、无菌7.5％（w/v）碳酸氢钠溶液规定体积，加注射用水（20℃～30℃）至规定体积，混匀。
　　(4) 如果必要，用1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol / L 盐酸溶液调pH至所需值。
　　(5) 溶液应在2℃－8℃下避光保存。具体使用方法参照培养基包装袋上的说明书。
3.3.2注意事项
　　1） 细胞培养用水一般为三蒸水（经石英蒸馏器蒸馏）或超纯水，医药生产上一般为注射用水。

　　2） 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用，因为包装一旦打开，组分可能会变质或因受潮而结团。
　　3） 溶解干粉培养基时先加入终体积90％－95％的培养用水，添加剂加完后再补足。
　　4） 如需添加的组分较多时，某一组分完全溶解后，再添加另一组分。
　　5） 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠，以免产生沉淀。
　　6） 所有成分完全溶解后，培养基应立即过滤或高压除菌，以免产生沉淀或有微生物污染。
　　7） 在过滤除菌时，一般情况下应调pH比所需值低0.1～0.2个单位，因过滤除菌后，pH值会升高约0.2。
　　8） 在细胞培养过程中，建议不加或加少量的抗生素，如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低 一些。
　　9） 建议用1N HCl或1N NaOH来调节培养基的pH，因为用碳酸氢钠来调对培养液的渗透压影响比较大。
3.4 灭菌方法
　　培养基的灭菌方法主要有两种，高压除菌及0.22μm微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比，高压灭菌的工作强度小，相对便宜，失败率低，但易造成营养成分的流失。而且很多细胞培养基由于营养成分丰富不能够采用高压方式进行灭菌。
3.4.1 高压灭菌
　　某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，例如宜兴赛尔的MEM培养基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，可在高压灭菌后加入。另外可高压的谷氨酸盐可代替L-谷氨酰胺。 为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证很关键，可高压灭菌的培养基在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，因此不需将灭菌时间延长。
3.4.2 过滤灭菌
　　大多数培养基采用0.1～0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌，并且已成为培养基除菌的发展方向，它可低限度地减少培养基的营养损失。
3.4.3 细胞培养液的储存
　　细胞培养液的储存条件一般为2－8℃、密闭、避光保存，但要注意如下几点：
　　1） 过滤后的完全培养液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用，一般在2－3周内使用完。培养液中的L-谷氨酰胺是不稳定的，不同温度L－谷氨酰胺的降解见下图：
　　2） 灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液，一般可在4℃保存6～9个月，也可冷冻保存，用时解冻。
　　3） 高压除菌后的培养基应置4℃保存，不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。
　　4） 添加某些生长因子、激素等添加物，可能会改变培养液的储存条件，比如温度、时间等方面的要求。

四、如何判断细胞培养基产品的品质

　　判断细胞培养基产品的品质一般有两条途径：首先，细胞培养基的质量是否执行了统一的质量标准，是否执行统一的检验项目和检验方法；其次，细胞培养基的生产过程是否执行GMP管理。
4.1是否严格执行国家统一的行业标准
　　《哺乳类动物细胞培养基》行业标准的制定与实施是规范国内细胞培养基产品质量的前提，统一执行该行业标准中提出的检验项目和检验方法是保障培养基产品质量的必然选择。
4.1.1《哺乳类动物细胞培基养》行业标准内容解读
　　必须注重细胞培养基的成分 行业标准首次提出细胞培养基“成分”的概念，在药品研发、生产、申报和管理时，对细胞培养基的要求不仅仅是名称，更重要的是成分。细胞培养基的组成成分才是细胞培养基的核心。目前按国内的习惯，生物制药企业在采购和使用细胞培养基时主要根据细胞培养基的名称来选择培养基，如MEM、199、DMEM等。但实际上，即使这些已有几十年历史的基础培养基，每一个品种也存在很多亚型。例如：
　　MEM细胞培养基：有过滤灭菌和高压灭菌之分；有Earle’s盐和Hanks’盐之分；有的还含有非必须氨基酸等。
　　DMEM细胞培养基：有低糖和高糖之分；有含丙酮酸钠和不含丙酮酸钠之分；有的还含有HEPES等。随着细胞培养技术的发展，细胞培养基也在不断发展，这些常见基础培养基的亚型也在不断增加，如低血清MEM、199、DMEM，高密度MEM、199等。不同的细胞培养基生产企业其培养基配方也有所不同，如某国外企业几年前推出的高级培养基（低血清）配方中含有重组胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白；国内某企业推出的血清替代物含有胰岛素样生长因子等。这些做法对于生物制药企业是不安全不负责任的，对于采用化学成分明确配方的细胞培养基同行也是不公平的竞争。另外，随着反应器悬浮培养技术的发展和应用，出现更多的针对某种细胞的无血清培养基，其配方是细胞培养基企业的核心技术、都是保密的，仅凭这些细胞培养基的名称不可能限定其成分、保证质量。因此，国际上药品申报和管理时，对细胞培养基的要求不仅仅只是名称，更重要的是成分。
　　关于批的概念
　　行业标准规定：使用同一台混合设备一次混合量所生产的均质产品为一批。如果没有经过最终混合设备混合，只是经过单个球磨缸球磨后合并成的批不符合行业标准对批的要求。
　　是否标有生产批号、生产日期、有效期等
　　行业标准规定：在标签、包装、检验报告中应明确标有细胞培养基的产品批号、生产日期、有效期至及标准编号。细胞培养基产品标签或检验报告中没有生产日期、有效期及行业标准编号的产品不能用于生物制品的生产。
　　细胞培养基产品是否每批检验？
　　行业标准规定：所有项目均为出厂检验项目，每批产品均必须检验。检验项目包括：澄清度、pH值、渗透压、干燥减量的质量分数、细菌内毒素、微生物限度（细菌数和霉菌数）、细胞生长试验，检验方法依据行业标准规定执行。
　　细胞培养基生产企业提供的检验报告应该为最终生产厂家或最终分装厂家的检验报告
　　某些进口培养基经过分装后需要重新检测，并出具分装后的检测报告。如果分装厂家提供原生产厂家的检验报告，则不能代表该产品质量指标。
　　行业标准规定了培养基的成分、要求、试验方法、检验规则及标志、包装、运输、贮存。
　　动物来源成分是被限制甚至禁止采用的。生物制药企业在评审和选择细胞培养基供应商时应要求该企业提供以下文件：
　　1、无血清、无动物组分声明
　　2、蛋白成分说明（主要指无血清细胞培养基成分中的植物蛋白或重组蛋白）
　　3、其它成分表（无需配比）
　　宜兴赛尔细胞培养基产品无动物来源成分声明
　　所有类别细胞培养基的原料均不含任何动物来源成分。所有类别细胞培养基的生产过程均不接触任何动物来源成分的物质。细胞培养基生产线不生产任何含动物来源成分的产品。
4.1.2 行业标准中规定的细胞培养基的检测方法
　　澄清度的测定
　　水是细胞培养基的溶剂。细胞培养基中的营养成分只有完全溶解于水才能被细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此细胞培养基是否溶解以及培养液是否澄清透明将直接影响培养基的使用效果。该项目是通过对水溶解后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的澄清度。宜兴赛尔企业标准规定取规定量供试品，加注射用水（水温20-30℃）至1L，搅拌溶解，溶液澄清。行业标准规定称取每升标示量的实验室样品，置于1 000mL烧杯中，加水1 000mL，搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅸ B进行。
　　pH值的测定
　　哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，pH过高或者过低都会导致细胞死亡。不加碳酸氢钠的pH值测定也可以检查细胞培养基的批间差。宜兴赛尔企业标准规定取规定量供试品，用注射用水（水温20-30℃）溶解至1L，用与细胞培养基溶液pH值相近的两点标准缓冲液校准后的酸度计进行测定；再加入规定量的碳酸氢钠完全溶解后，用经校准的酸度计进行测定。碳酸氢钠添加量参考附录6。行业标准规定称取每升标示量的实验室样品，置于1 000mL烧杯中，加水1 000mL，搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H 进行；加入规定量的碳酸氢钠（见附录6）到上述溶液中，按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行。
　　干燥减量的质量分数
　　细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥减量的质量分数表示产品中含水量。细胞培养基是有菌制剂，其丰富的营养成分有利于微生物生长，控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养基的养分。行业标准规定了细胞培养基的干燥减量的质量分数为5％。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进行。
　　渗透压
　　溶剂通过半透膜由低浓度向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗透所需施加的压力，称为渗透压。
细胞必须生活在等渗环境中，动物细胞借助K＋、Na＋维持渗透平衡。大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水萎缩，培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂，因此要控制培养基的渗透压范围。行业标准规定了每种细胞培养基产品渗透压值的允许偏差范围为±5％。行业标准规定称取每升标示量的实验室样品，置于1 000mL烧杯中，加水1 000mL，搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法进行；加入规定量的碳酸氢钠（见附录6）到上述溶液中，按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法进行。
　　细菌内毒素
　　细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。它的特殊性在于不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。培养基细菌内毒素过高,对生物制品的质量包括纯度、引起不良反应等方面有较大影响，而且会降低生物制品的产率。中国药典规定，疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程药品等注射用的药品都需要检查细菌内毒素。因此本项目的检验符合生物制品质量控制要求。常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为＜10EU/ml。行业标准规定称取1/100每升标示量的实验室样品，精确至0.0001g，加入细菌内毒素检查用水10mL溶解，吸取该溶液0.1mL加细菌内毒素检查用水3.9mL，混匀即得试验溶液。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。
　　微生物限度
　　细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。宜兴赛尔在参考《中华人民共和国药典》2005版二部附录第100页的口服给药制剂的微生物限度标准，并严于该标准，规定细胞培养基产品的细菌数每1g不得超过200个，霉菌数每1g不得超过50个。行业标准规定按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。称取样品1g，加入无菌纯化水10mL溶解，混匀即得试验溶液。
　　细胞生长试验
　　这是一个性能特性表述的要求。细胞培养基的功能就是培养哺乳类动物细胞，因此经过细胞培养效果的检验是产品质量优劣的直观表述，这也是很多生物制药用户要求的一项指标。目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，宜兴赛尔的试验方法参考《体外培养的原理与技术》中细胞计数法论述的内容给出。按产品说明书配制培养液进行细胞培养，前72小时用含10％小牛血清的培养液培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基是否有促生长的能力。后48小时用不含小牛血清的培养液维持培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基中是否有不利细胞生长的毒素。本试验用细胞为Vero细胞。
4.2是否有效实施GMP管理
　　细胞培养基作为生物制药的重要原料，它的生产从人员、设施与设备、生产过程、质量控制等方面须按GMP 严格要求，这是保障细胞培养基产品品质的必要条件。建立统一的《细胞培养基生产质量管理规范》，严格执行细胞培养基的工艺规程和操作规程，实现每批次细胞培养基的可追溯管理，已经成为培养基行业发展的必然趋势。考虑到细胞培养基是生物制药的原料，因此细胞培养基的生产从原料、人员、设施设备、生产过程、质量控制等方面均应有质量要求，是保障细胞培养基合格产品生产的必要条件。宜兴赛尔在通过了中国质量认证中心以及国际认证联盟的ISO9001 认证的同时，将GMP 规范引入细胞培养基的生产全过程，并严格遵从该规范。