一、细胞培养概述

　　细胞培养技术正在迅速发展，在过去的十年中，哺乳动物细胞系中运用重组技术也孕育了许多新型制药类产品。动物细胞来源的产品通常被认为比单个组织来源的产品要复杂。相对应细菌和大多数的酵母来说，动物细胞能够高效的生产复杂的改造后的翻译后产物，如糖基化转移产物。这类改造对于蛋白质的生物学活性很重要，同时对其可溶解性、稳定性、分泌功能和3D结构也有重要作用。由动物细胞技术生产的制药产品有：单抗、病毒、重组蛋白和多肽。这些产品在生物基础研究中是重要的手段和工具并在医学研究中也有广泛应用。
　　工业生产中，最重要的细胞类型是杂交瘤细胞、非洲绿猴肾细胞系（VERO）、中国仓鼠细胞（CHO）、BHK细胞和由杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞。杂交瘤细胞能够分泌单抗，而VERO和CHO可以分别生产病毒和重组蛋白。CHO细胞系被特殊的应用于需要转录后糖基化修饰的重组蛋白表达，以此能够生产出具有完整功能的产品，如：人组织型纤溶酶原激活物、人干扰素、人单克隆抗体。
　　昆虫细胞培养技术在过去的二十年中也有快速的发展，前景比较广阔的应用领域有重组蛋白生产，他是使用杆状病毒表达系统进行表达的，在生物和人体健康领域应用广泛。
　　比起细菌和酵母的生长条件来说，动物细胞培养更加复杂，所需的营养物质更加复杂。上世纪初研究细胞培养所用的培养基是采用了没有提纯过的血浆、血清和鸡胚提取物等。1950年代取得的一个重要的突破就是提纯过的培养基能够支持哺乳动物细胞的生长。这种基础培养基中除了含有盐和葡萄糖外，还含有游离氨基酸和维生素。为保持基础培养基的可行性，大多数哺乳动物培养基中都需要添5%-20%的血清，通常是胎牛血清（FCS）。血清能够提供丰富的营养组分，包括胰岛素在内的一些激素、生长因子、转运蛋白、白蛋白、促贴壁因子等等。
　　尽管动物血清在细胞培养中有很多的优点，但仍然存在一些不足：
　　1、下游生产中去除蛋白的操作，而此类操作通常很昂贵
　　2、微生物的潜在污染：真菌、细菌、病毒、支原体或其他传染物（eg：BSE）
　　3、质量不稳定以及价格昂贵
　　4、进出口管制影响盈利
　　随着BSE以及其他传染性疾病的爆发，生物安全问题的重要性被提上议程。在目前和将来的诊疗型生物产品的生产中由于原材料中动物源性污染的担忧，一些客户迫切的需要减少动物源的成分。当使用低血清培养基时，细胞生长水平的维持（包括生产蛋白的特性）必须与包含血清培养时效果一样或者更佳。另外，在持续培养的条件下通常需要稳定支持细胞系的生长，以优化生产过程。
　　近几年的发展是在动物细胞培养基中采用非动物来源的蛋白水解物。植物蛋白水解物可以作为血清和游离氨基酸的替代。此系列在许多文献中被报道非常有效。作为促进生长的蛋白水解物，蛋白水解物应用于细胞培养中有以下一些特殊的功能：
　　1、多肽可以促进贴附和扩增
　　2、直接用于哺乳动物细胞培养中的氨基酸来源（作为游离氨基酸的替代）
　　3、保护细胞免受剪切力的影响（替代白蛋白）
　　4、间接促进细胞的生长（替代血清）
　　许多哺乳动物细胞生长需要附着和支撑，通过附着于某一个底物来复制扩增，蛋白水解物就能起到促进贴附作用，从而代替了贴附因子和扩增因子的作用。
　　当蛋白水解物被用于氨基酸来源时，游离氨基酸总数和短肽的数量就尤为重要了，除了氨基酸转运系统，哺乳动物细胞同样拥有独立的特殊的多肽转运系统。二肽和三肽有同样的贴附作用并拥有同样的转运系统。四肽以及更高的寡多肽类大多数不是直接运输的。多肽类物质通过细胞膜上的质子（H+）实行协同转运，然而单个游离氨基酸则通过钠离子协同转运。因此细胞摄取水解物中的二肽及三肽就比摄取游离氨基酸要高效的多。

二、细胞培养基的基本组分

　　细胞培养基是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。细胞培养基是组织细胞培养最重要的条件。最初完成的体外细胞培养采用的是天然培养基，即从动物体液或组织中分离提取的营养物。体外培养动物细胞有近百年历史，但真正得以广泛应用和各种类型组织细胞大量体外培养成功是由于适合细胞体外生长的合成培养基的问世。实际工作中往往将天然培养基和合成培养基结合使用。
合成培养基的种类繁多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些其他辅助性成分。
2.1氨基酸
　　氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺.
2.2碳水化合物
　　碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脱氧核糖,丙酮酸钠和醋酸等.
2.3无机盐
　　培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能.培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg 320 mOsm/kg.标准培养液的渗透压在此范围内波动.特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质.向培养液中添加HEPES时需按以下方法调节钠离子浓度.
2.4缓冲系统
　　大多数细胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是,细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4).由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲,因此,气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%,培养液中NaHCO3的加入量为1.97g/L;如果CO2浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为3.95g/L.细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换. HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加.在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中.大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色.
2.5维生素
　　在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源, 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长.
2.6其它成分
　　在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分.如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇(2-Me).2-Me 对细胞生长有很重要的作用.有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用.同时避免过氧化物对培养细胞的损害.另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞.2-Me是一种小分子还原剂,极易氧化.分子量为78.13,纯的2-Me是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(Do20),常用终浓度为5×10-5M.常配制成0.1M的储存液,用时每升培养液加0.5ml。